第20题:
问答题
什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?
正确答案:
K.lenow酶是1974年 Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA聚合酶 I,得到两个片段,其中大片段的分子量为 75kDa,它具有 5’→ 3’聚合酶和 3’→ 5’外切核酸酶的活性,小片段具有 5’→ 3’外切核酸酶活性。由于大片段失去了 DNA聚合酶 I中会降解 5’引物的 5’→ 3’外切核酸酶的活性,所以在基因工程中更有用。 Klenow酶主要有下列用途:
(1)修复反应,制备平末端可用 Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其分方法产生的 5’或 3’突出末端,制备平末端,这样可以使原来具有不相容的黏性末端的 DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸,用这种末端填补的方法可以制备3’末端标记的探针。用 Klenow 酶修复 5’突出末端的反应主要是利用了 Klenow 酶的 DNA聚合酶活性,是填补反应;而修复 3’突出末端则是用 Klenow酶的 3’→ 5’外切核酸酶的活性,是切割反应。用 Klenow酶的切割反应来修复 3’突出末端是不理想的,改用 T4DNA 聚合酶或其他的酶是更好的选择。
(2)标记 DNA3’突出末端(protmding end)该反应分两步进行:先用 3’→ 5’的外切核酸酶活性除去 3’突出末端,产生 3’隐含末端,然后在高浓度的标记底物(α~32p_dNTP)存在下,使降解(3’→ 5’)作用与聚合(5’→ 3’)作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange/replacem—entreaction)。不过这一反应用 T4DNA 聚合酶的效果更好,因它的 3’→ 5’外切核酸酶活性较强。
(3)其他的一些用途:包括用双脱氧末端终止法进行 DNA序列分析、用于 cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链 DNA探针等。
解析:
暂无解析